RNAstorm™试剂盒

全球领先的FFPE样本RNA抽提技术来了!得率超QIAGEN30倍,RNA完整性高至4k!!!

  为了更好的进行NGS测序,使用NAstorm™试剂盒催化FFPE石蜡标本的核酸抽提,具有更高得率和 更完整RNA,制备文库用于RNA-Seq

 

 

简介

活检和手术标本通常用甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)的 常用模式保存。虽然甲醛使组织更稳定有利于保存,但是样 本内部的核酸和其他生物分子也形成广泛的交联和加合物。 目前的方法主要依赖于加热来去除交联和加合物,但只是部 分有效,并且导致核酸例如RNA的不稳定和断裂。相比之 下,Cell Data Sciences公司开发的RNAstorm™试剂盒, 包含CAT5™催化技术,极大地加快了甲醛损伤的去除,并 且可以在常温环境下进行,明显提高了RNA的回收率。此技 术增强了产生大量高质量核酸的机会,从而可用于多样化的 应用,包括RNA测序或其他NGS,qPCR, 生物芯片和基因表达分析

The RNAstorm™ 试剂盒

RNAstorm™提取试剂盒包含加快甲醛诱导加合物改变 的化学催化剂,包括烷基化和交联碱基。 试剂盒提供了从石蜡组织样本提取RNA所必需的所有试 剂,右边是用户操作流程(见图),大约1小时以内完成。 用切片机进行石蜡切片,首先用无毒无二甲苯的试剂去 除包埋组织的石蜡。其次,组织用CAT5™试剂处理,并且 用蛋白酶裂解。RNA结合到柱子上并冲洗,用DNase I去除 基因组DNA的污染。最后,用无RNA酶的水或低盐缓冲液 洗脱获得纯的RNA

评价FFPE来源的RNA的质量和数量
以下技术通常用来评价一个RNA样品的质量:
简单的浓度测量采用紫外光谱法(例如NanoDrop™) 或利用RNA特异性荧光染料(如Qubit™)。
RNA的完整性使用凝胶或毛细管凝胶电泳方法,例如安 捷伦生物分析仪仪器,并表示为一个RIN数字或DV200百 分比。
测量应用性,这直接取决于足够的化学去修饰或未交联 由反转录酶和酶处理的RNA的数量。选择的方法是定量RTPCR,结果可以表示为一个Ct数或相对或绝对量的RNA。 在NGS文库制备中,应用性是对输入核酸的最可靠的方 法。

图1。从六个不同的FFPE标本RT-PCR定量RNA恢复的比较。“Kit Q“代 表了一个市场领先的竞争商业基因组提取试剂盒。相对量 RNA从每个样品 中观察到的CT值。
对正常的肿瘤石蜡标本的几种类型。最老的石蜡样品是在 1976年,最新的在2015年。 定量RT-PCR方法扩增RNA的相对定量。测量Ct值均一式三 份。一个83 bp的扩增产物从一个高表达基因(TPT1)中 使用,熔融曲线 确保放大的特异性分析

定量RT-PCR是判断一个RNA样品整体质量最好的方 法,因为它依赖于浓度,完整性,以及样品应用性,因此这 说明 主要依靠qPCR数据。其他的方法有着明显的缺陷,尤 其是对FFPE样品中RNA的降解。具体来说,Nanodrop™和 Qubit™ 措施可以高度准确。毛细管电泳是核酸碎片程度的 有用指标,虽然RIN数与下游分析不能完全相关,不同质量 的样品有非常相似的RIN数。DV200(RNA片段率>200 bp)是首选措施,尤其是当结束在Illumina平台使用RNAseq时。这个度量因此作为估计RNA完整性的一点。
检测从FFPE样品恢复的扩增RNA Cell Data Sciences’的商业RNAstorm™ RNA FFPE 基因组提取试剂盒是在几个FFPE样品中测试。为确保RNA 回收的可重复性和定量测量,对石蜡包埋切片提取各一式三 份组织块采用RNAstorm™试剂盒和一个流行的商业试剂盒 (试剂盒Q)。

 

注: 从 FFPE 样品中提取RNA
RNA的相对量基于在图1中Ct值的观察和绘制,其中Ct差对 应浓度的两倍的差异。 RNAstorm™ 试剂盒大大提高了扩增RNA的产量 对所有样本进行检测,如图1所示,重要的和一致的增加是 通过定量PCR检测观察的。Ct值通过RNAstorm™ 试剂盒 相对于试剂盒Q的比较值如表1所示。
表1.恢复扩增RNA的成倍增加,从图2 Ct值推断,通过定量RT-PCR检

样本 Ct (RNAstorm) Ct (Kit Q)
正常肝脏 1 29.2 32.5
正常肝脏2 30.8 35.8
正常肾脏 29.5 31.3
肾上皮癌细胞 31.4 36.1
结直肠癌1 30.4 32.1
结直肠癌2 28.1 31.0

表1.恢复扩增RNA的成倍增加,从图2 Ct值推断,通过定量RT-PCR检 测,使用RNAstorm试剂盒优于Kit Q

图2。毛细管电泳分析测量的RNA的大小分布(安捷伦2100生物分析 仪)肾细胞癌样本显示RNA与RNAstor获得改进的完整性 ,应用 RNAstorm™ 试剂盒。

图3。基于安捷伦生物分析仪毛细管电泳结果dv200测量RNA完整性的 比较。“KIT Q”代表一个市场领先的竞争商业基因组提取试剂盒

而通过Qubit 测量的RNA浓度也普遍较高(数据未显 示),这些浓度差异不足以解释RNAstorm™ 试剂盒相对 于试剂盒Q的Ct值的差。这表明RNA的完整性和化学修饰性 和交联程度在测试样品中扮演重要角色,并在FFPE样品 qPCR表现一般。 增加RNA完整性是使用RNAstorm™试剂盒观察的 利用毛细管电泳观察RNA完整性增加。样品用6000纳米的 总RNA试剂盒,在Agilent 2100生物分析仪仪器处理,数 据 使用Agilent专业软件分析。作为一个例子,获得组织样 本的痕迹(肾细胞癌)在图2中显示的。
如上所述,在RIN的数字代替DV200,如图3所示。30%的 值已经由Illumina公司确定允许RNA测序文库制备与Tru Seq试剂进行阈值。这里,大多数样品测试取得了DV200的 值小于30%,与竞争对手的试剂盒测试时。相反,在 RNAstorm试剂盒观察值明显升高47~70%。
结论
据估计,数亿患者FFPE样品是目前在世界范围内存在的生物银行,每年产生数以百万的新样本。由于可通过NGS下一 代测序的方法丰富信息,分析该病人数据的需求将继续增加。然而,核酸提取方法迄今未能提供必要的核酸测序可靠质 量。NGS库准备依靠多个酶促步骤,包括反转录和扩增,这需要高度的核酸完整性和应用性。RNAstorm™试剂盒提供的 样品处理液专为先进的下游应用,允许最终用户可靠地挑战玛琳固定标本这种有价值的工作。

       参考文献:

1. Karmakar et al., Organocatalytic Reversal of Formaldehyde Adducts of RNA and DNA Bases, Nature Chemistry 2015, 7, 752758; doi:10.1038/nchem.2307 2. Arreaza et al., Pre-Analytical Considerations for Successful Next-Generation Sequencing (NGS): Challenges and Opportunities for Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tumor Tissue (FFPE) Samples, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1579; doi:10.3390/ ijms17091579 3. Evaluating RNA Quality from FFPE Samples: Guidelines for obtaining high-quality RNA sequencing results from degraded RNA with the TruSeq® RNA Access Library Preparation Kit, Illumina Inc., downloaded at http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote-truseq-rna-access.pdf

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  CD501 (50 reactions) CELLDATA
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