全球领先的杂志Nature chemistry报道的FFPE样本RNA抽提技术来了！在某些样本中得率比Kit Q有较大改善，RNA完整性高至4K。
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The RNAstorm™ 试剂盒
RNAstorm™提取试剂盒包含加快甲醛诱导加合物改变 的化学催化剂，包括烷基化和交联碱基。 试剂盒提供了从石蜡组织样本提取RNA所必需的所有试 剂，右边是用户操作流程（见图），大约1小时以内完成。 用切片机进行石蜡切片，首先用无毒无二甲苯的试剂去 除包埋组织的石蜡。其次，组织用CAT5™试剂处理，并且 用蛋白酶裂解。RNA结合到柱子上并冲洗，用DNase I去除 基因组DNA的污染。最后，用无RNA酶的水或低盐缓冲液 洗脱获得纯的RNA
评价FFPE来源的RNA的质量和数量
以下技术通常用来评价一个RNA样品的质量：
简单的浓度测量采用紫外光谱法（例如NanoDrop™） 或利用RNA特异性荧光染料（如Qubit™）。
RNA的完整性使用凝胶或毛细管凝胶电泳方法，例如安 捷伦生物分析仪仪器，并表示为一个RIN数字或DV200百 分比。
测量应用性，这直接取决于足够的化学去修饰或未交联 由反转录酶和酶处理的RNA的数量。选择的方法是定量RTPCR，结果可以表示为一个Ct数或相对或绝对量的RNA。 在NGS文库制备中，应用性是对输入核酸的最可靠的方 法。
图1。从六个不同的FFPE标本RT-PCR定量RNA恢复的比较。“Kit Q“代 表了一个市场领先的竞争商业基因组提取试剂盒。相对量 RNA从每个样品 中观察到的CT值。
对正常的肿瘤石蜡标本的几种类型。最老的石蜡样品是在 1976年，最新的在2015年。 定量RT-PCR方法扩增RNA的相对定量。测量Ct值均一式三 份。一个83 bp的扩增产物从一个高表达基因（TPT1）中 使用，熔融曲线 确保放大的特异性分析
定量RT-PCR是判断一个RNA样品整体质量最好的方 法，因为它依赖于浓度，完整性，以及样品应用性，因此这 说明 主要依靠qPCR数据。其他的方法有着明显的缺陷，尤 其是对FFPE样品中RNA的降解。具体来说，Nanodrop™和 Qubit™ 措施可以高度准确。毛细管电泳是核酸碎片程度的 有用指标，虽然RIN数与下游分析不能完全相关，不同质量 的样品有非常相似的RIN数。DV200（RNA片段率＞200 bp）是首选措施，尤其是当结束在Illumina平台使用RNAseq时。这个度量因此作为估计RNA完整性的一点。
检测从FFPE样品恢复的扩增RNA Cell Data Sciences’的商业RNAstorm™ RNA FFPE 基因组提取试剂盒是在几个FFPE样品中测试。为确保RNA 回收的可重复性和定量测量，对石蜡包埋切片提取各一式三 份组织块采用RNAstorm™试剂盒和一个流行的商业试剂盒 （试剂盒Q）。
注: 从 FFPE 样品中提取RNA
RNA的相对量基于在图1中Ct值的观察和绘制，其中Ct差对 应浓度的两倍的差异。 RNAstorm™ 试剂盒大大提高了扩增RNA的产量 对所有样本进行检测，如图1所示，重要的和一致的增加是 通过定量PCR检测观察的。Ct值通过RNAstorm™ 试剂盒 相对于试剂盒Q的比较值如表1所示。
表1.恢复扩增RNA的成倍增加，从图2 Ct值推断，通过定量RT-PCR检
| 样本 | Ct (RNAstorm) | Ct (Kit Q) |
| 正常肝脏 1 | 29.2 | 32.5 |
| 正常肝脏2 | 30.8 | 35.8 |
| 正常肾脏 | 29.5 | 31.3 |
| 肾上皮癌细胞 | 31.4 | 36.1 |
| 结直肠癌1 | 30.4 | 32.1 |
| 结直肠癌2 | 28.1 | 31.0 |
表1.恢复扩增RNA的成倍增加，从图2 Ct值推断，通过定量RT-PCR检 测，使用RNAstorm试剂盒优于Kit Q
图2。毛细管电泳分析测量的RNA的大小分布（安捷伦2100生物分析 仪）肾细胞癌样本显示RNA与RNAstor获得改进的完整性 ，应用 RNAstorm™ 试剂盒。
图3。基于安捷伦生物分析仪毛细管电泳结果dv200测量RNA完整性的 比较。“KIT Q”代表一个市场领先的竞争商业基因组提取试剂盒
而通过Qubit 测量的RNA浓度也普遍较高（数据未显 示），这些浓度差异不足以解释RNAstorm™ 试剂盒相对 于试剂盒Q的Ct值的差。这表明RNA的完整性和化学修饰性 和交联程度在测试样品中扮演重要角色，并在FFPE样品 qPCR表现一般。 增加RNA完整性是使用RNAstorm™试剂盒观察的 利用毛细管电泳观察RNA完整性增加。样品用6000纳米的 总RNA试剂盒，在Agilent 2100生物分析仪仪器处理，数 据 使用Agilent专业软件分析。作为一个例子，获得组织样 本的痕迹（肾细胞癌）在图2中显示的。
如上所述，在RIN的数字代替DV200，如图3所示。30%的 值已经由Illumina公司确定允许RNA测序文库制备与Tru Seq试剂进行阈值。这里，大多数样品测试取得了DV200的 值小于30%，与竞争对手的试剂盒测试时。相反，在 RNAstorm试剂盒观察值明显升高47～70%。
结论
据估计，数亿患者FFPE样品是目前在世界范围内存在的生物银行，每年产生数以百万的新样本。由于可通过NGS下一 代测序的方法丰富信息，分析该病人数据的需求将继续增加。然而，核酸提取方法迄今未能提供必要的核酸测序可靠质 量。NGS库准备依靠多个酶促步骤，包括反转录和扩增，这需要高度的核酸完整性和应用性。RNAstorm™试剂盒提供的 样品处理液专为先进的下游应用，允许最终用户可靠地挑战玛琳固定标本这种有价值的工作。
参考文献:
1. Karmakar et al., Organocatalytic Reversal of Formaldehyde Adducts of RNA and DNA Bases, Nature Chemistry 2015, 7, 752758; doi:10.1038/nchem.2307 2. Arreaza et al., Pre-Analytical Considerations for Successful Next-Generation Sequencing (NGS): Challenges and Opportunities for Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tumor Tissue (FFPE) Samples, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1579; doi:10.3390/ ijms17091579 3. Evaluating RNA Quality from FFPE Samples: Guidelines for obtaining high-quality RNA sequencing results from degraded RNA with the TruSeq® RNA Access Library Preparation Kit, Illumina Inc., downloaded at http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote-truseq-rna-access.pdf
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